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Tunel染色

服務介紹:

Tunel染色即原位末端轉移酶標記技術。凋亡細胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口,產生一系列3’-OH末端,在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)作用下,將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標記到DNA的3′末端,從而進行凋亡細胞的檢測。TUNLE染色是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。

技術原理:

晚期凋亡細胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產生粘性3'-OH末端,在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的催化下,將帶有生物素(Biotin)分子的dUTP,標記到DNA的3'-末端,隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈酶親和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)結合,最后通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞,這就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細胞凋亡的原理。

實驗流程:

 
 
關鍵實驗步驟:

1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60oC 20min,再用使用二甲苯兩次5-10min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結合反應充分、均勻;

2.把握好細胞通透的時間。一般根據(jù)切片的厚薄,選擇蛋白酶k的孵育時間,常用10-30min,幾μm切片用短時間;幾十μm切片用長時間,通過摸索達到既不脫片,有能夠使后面的酶和抗體進入胞內。

3.適當延長TUNEL反應液的時間。一般是37oC1h,你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度,選擇更長的時間,可長至2h,但要結合你最終的背景著色。

4.DAB顯色條件的選擇。一般DAB反應10min左右,結合鏡下控制背景顏色,最長不超過30min;promega公司提供的DAB液(桃紅色),不利于辨認棕褐色,我不太喜歡。

5.PBS的充分清洗。在TUNEL反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格,可增加次數(shù)達5次,因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。

6.內源性POD的封閉也十分關鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織,我的經驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,可以達到很好的封閉效果,且不影響最終的特異性染色。

實驗結果展示:

注意事項:

1、洗滌蛋白酶K時,一定要PBS沖洗3次,如果沖洗不凈會嚴重干擾后續(xù)的標記反應;

2、3%的過氧化氫溶液孵育時間不應過長,否則會出現(xiàn)過氧化氫導致的DNA斷裂,產生假陽性

3、滴加Tunel檢測液時,可利用防蒸發(fā)膜防止其蒸發(fā)影響樣本的生物素標記;配制好的DAB顯色液必須一次性使用完畢,不宜凍存。

常見問題:

無/弱染色?

烤片溫度過高,推薦56℃-60℃1-2h;

一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時間過短等。

染色過深?

染色試濃度過高或孵育時間過長;

顯色劑濃度過高或孵育時間過長。


送樣運輸要求:

1、石蠟切片常溫、組織由標準的石蠟包埋盒包埋,石蠟與組織要均勻接合,不能有裂痕;蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定,有效厚度至少要超過0.1cm。盡量提供半年內的組織蠟塊,超過半年的蠟塊抗原可能丟失,做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白。

2、冰凍切片-20℃、固定后細胞爬片4℃。
 


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