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原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

日期:2024-09-12 返回

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.組織脫水:梯度酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水處理,75%酒精(4h)-85%酒精(2h)-90%酒精  (1.5h)-95%酒精(1h)-無(wú)水乙醇I(0.5h)-無(wú)水乙醇Ⅱ(0.5h );

2. 組織透明:組織塊經(jīng)酒精脫水后必須經(jīng)過(guò)透明。透明劑(二甲苯)能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織,無(wú)水乙醇:二甲苯(1:1)(10min)-二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min);

3.浸蠟:透明后的組織塊依次經(jīng)3缸石蠟(60℃)進(jìn)行浸蠟,石蠟Ⅰ(60℃)(1h)-石蠟Ⅱ(60℃)(1h )-石蠟Ⅲ(60℃)(1h);

以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟都在生物組織脫水機(jī)里面完成(機(jī)器自動(dòng)程序)。

4.包埋:包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟塊中。包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于浸蠟溫度,保證組織塊與包埋石蠟完全融為一體。

5.切片和烤片 :包埋好的蠟塊使用徠卡病理切片機(jī)進(jìn)行切片,切好的組織片放入40℃的水浴鍋中進(jìn)行攤片,防脫玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于60℃ 烤箱烤片3個(gè)小時(shí)即可。

6.切片脫蠟:將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ(20min)-二甲苯Ⅱ(20min)-二甲苯Ⅲ(20min)-無(wú)水乙醇Ⅰ(5min)-無(wú)水乙醇Ⅱ(5min)-95%酒精(5min)-90%酒精(5min)-80%酒精(5min)-70%酒精(5min),然后蒸餾水浸洗5min,DEPC水浸泡。

7.切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化5min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

8.滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。

9.傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液,65℃恒溫箱度雜交過(guò)夜。

10.2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗5min洗2次,0.5×SSC室溫洗10min。

11.DAPI避光復(fù)染5min,清洗后用抗熒光淬滅劑封片;

12.熒光顯微鏡下觀察。




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